1 前言
鬼針草具有多方面的藥理活性, 抑菌及抗炎、對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗高血脂及血栓形成等作用, 在臨床應(yīng)用上具有很好的效果。維生素K1 (V K1) 又名葉綠醌, 為黃色油狀物, 廣泛存在于天然綠色植物中, 有促進(jìn)血液凝固的作用。V K1 可用來治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和骨折。有學(xué)者認(rèn)為肝癌的發(fā)生與維生素K 缺乏有關(guān),V K1 對動(dòng)脈硬化的治療也具有很好的作用。鬼針草中V K1 的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道, 本實(shí)驗(yàn)對鬼針草中V K1 的含量進(jìn)行定性和定量研究。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2. 1 試劑和儀器
2. 1. 1 試劑
鬼針草樣品1 和樣品2: 分別于2006 年5 月3 日和5 月13 日采摘于輝縣山區(qū), 洗凈、晾干、磨碎、過篩; 磷酸氫二鈉; 丙酮(分析純) ; 石油醚(沸程30—60℃, 分析純) ; 無水硫酸鈉; 甲醇(色譜純) , 正己烷(色譜純) ;V K1 標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma 公司, 純度> 98% ) ; 洗脫液: 石油醚∶**(97∶3) ; 標(biāo)準(zhǔn)儲備液: 取50mg V K1 標(biāo)準(zhǔn)品, 用正己烷溶解定容至50mL , 即濃度為1. 0mgöm L , 零下8℃避光保存。
2. 1. 2 儀器
Agilengt1200 液相色譜儀 ; RE252 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;梅特勒AL 2104 電子天平(梅特勒基礎(chǔ)型分析天平（AB-L系列）)。
2. 2 樣品的測定方法
植物中V K1 的測定方法有分光光度法、薄層色譜法及液相色譜(HPLC) 法。本實(shí)驗(yàn)選用失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁做色譜柱, 對樣品進(jìn)行凈化處理, 然后再進(jìn)行HPLC 分析, 取得較好的分離效果。
2. 2. 1 樣品的提取及凈化
稱取已磨碎過篩的脫水鬼針草樣品3. 4g,進(jìn)行樣品提取、裝柱、凈化, 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器收集流出液, 流出液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮近干, 取下用氮?dú)獯蹈珊? 用正己烷定容為1. 0mL。將定容液移入小塑料離心管中, 5000rpm 離心5m in, 上清液供HPLC 分析。
2. 2. 2 樣品的測定
HPLC 色譜分析條件分析柱: ZORBAX SB2C18, 5Lm, 4. 6mm ×150mm; 流動(dòng)相: 甲醇∶正己烷(75∶25) ; 進(jìn)樣量: 20LL; 柱溫: 20. 8℃; 流速1. 5mL öm in; 紫外檢測器: 波長248nm , 量程0. 05。取樣品凈化液20LL 注入液相色譜儀中進(jìn)行分析, 樣品2. 2 分別注入5 次, 數(shù)據(jù)見表1。2. 2. 3 樣品的分析用標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間對樣品進(jìn)行定性分析: 取空白樣和標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣進(jìn)行分析(分析條件與樣品相同) , 色譜峰保留時(shí)間為2. 18±0. 1m in, 如圖1。在本實(shí)驗(yàn)條件下, 鬼針草樣品在2. 18±0. 1m in 有峰出現(xiàn), 確認(rèn)鬼針草中存在維生素K1。
3 結(jié)果與討論
3. 1 校準(zhǔn)曲線的繪制
分別取維生素K1 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0. 25, 0. 50, 1. 00, 2. 00, 3. 00, 4. 00, 5. 00mL , 加入至50mL 容量瓶中, 即校準(zhǔn)曲線中各點(diǎn)V K1 含量分別相當(dāng)于5, 10, 20, 40, 60, 80, 100LgömL。然后再按2. 2. 3 條件進(jìn)行HPLC 測定, 記錄峰高。以標(biāo)準(zhǔn)含量C 為橫坐標(biāo), 峰高h 得回歸方程, h = - 0. 78607+2. 93053C,R = 0. 9996, RSD= 2. 52%。檢測限: 取15—20m in 基線的zui高峰與zui底峰差值的值的5 倍, 由回歸方程測出濃度, 即為檢測限, zui小檢測限為2. 0mgöL.
3. 2 結(jié)果計(jì)算
式中: X ——樣品中V K1 的含量, Lgö100g; C ——由回歸方程求出的V K1 的含量, Lg; 2——樣品提取后的定容體積,mL ; V 1——樣品凈化處理時(shí)的提取液量,mL ; V 2—— 樣品凈化后的定容體積,mL ;M ——樣品質(zhì)量, g。V K1 含量: 樣品1 中為2697. 4—3003. 5Lgö100g, 樣品2 中為3404. 1—3571. 7Lgö100g。
3. 3 回收率的測定
分別取樣品1 和樣品2 的凈化液, 加入等體積的V K1 標(biāo)準(zhǔn)液, 操作步驟同樣品, 上機(jī)分析, 重復(fù)5 次, 記錄峰高, 樣品回收率為94. 97% —100. 5%。
4 結(jié)論
通過對不同時(shí)期的兩種樣品定量分析, 發(fā)現(xiàn)鬼針草V K1 的含量是變化的, 隨著生長期的增長而增加, 這些為鬼針草在醫(yī)學(xué)上的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)和參考, 為以后鬼針草的開發(fā)和利用創(chuàng)造了條件。
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